在耐药胰腺癌细胞中触发主动铁死亡的铁敏感前药物
持久性癌细胞通常代表罕见的细胞群，这些细胞易于可逆地出现与遗传改变无关的药物耐受细胞状态。特别是，上皮间充质可塑性(EMP)是细胞能够可逆地具有干细胞样特性的生物学状态，它可以赋予细胞增殖能力降低和转移潜力增加的特性。天然产物盐霉素(1)先前已被证明优先靶向处于间充质状态的癌细胞。有人认为1和其他离子载体天然产物，如 narasin (2)、nigericin (3) 和monensin (4)通过与碱金属（例如 Na+、K+）的结合和转运发挥细胞毒性，这主要是从天然产物金属配合物的晶体结构中推断出来的。虽然这些化合物确实可以改变细胞离子通量，并对所有类型的细胞表现出毒性，但将碱离子通量与癌细胞间充质状态对这些化合物的显著敏感性联系起来的机制仍不清楚。有趣的是，细胞可塑性标志分化簇44（CD44）是细胞间充质状态的特征，也是癌症预后不良的标志，它通过介导铁的内吞作用调节细胞可塑性。癌细胞通过上调CD44来增加细胞中的铁含量，在CD44中，铁作为α-酮戊二酸盐依赖的去甲基化酶的金属催化剂来解锁间充质基因的表达。
Figure 1.Molecular structures of natural product ionophores
研究表明，1及其有效衍生物irononomycin(5)可在溶酶体室中积累，并与该细胞器中的铁相互作用和隔离，内在地导致活性氧(ROS)的产生和细胞死亡。在这种情况下，癌干细胞样和间充质状态的铁成瘾可以为这些细胞提供对经典化疗药物的克隆优势，同时赋予其对铁死亡的脆弱性。5优先杀死过表达CD44的癌细胞。因此，药物敏感性是由细胞的状态控制的，而不是他们的遗传背景。
研究发现C20的氨基衍生物如5在体外和体内都比母体天然产物更有效。相比之下，它的甲酯类似物6不太容易与包括铁在内的金属相互作用，并显示出降低的细胞毒性。因此，我们推断用二氢青蒿素(DHA)功能化5的羧酸盐以获得7，可以使溶酶体中的铁选择性激活这种前药物。这是由于先前的报告显示，含有内过氧化物桥DHA很容易被Fe(II)还原。因此，激活率和药物效力将反映CD44高表达细胞在间充质癌细胞状态下溶酶体中较高的铁含量。此外，这种细胞内药物前激活机制旨在阻止碱金属在细胞外结合，并在细胞内运输，以减少对健康细胞的毒性。
Figure 2.Molecular structures of synthetic derivatives of salinomycin including ironomycin and ironomycin−dihydroartemisinin chimera.
作者以DHA为羧酸掩蔽基团，设计了一系列天然产物嵌合体。首先认为5是一个有趣的起始材料，因为它包含一个末端炔烃，适合通过原位点击化学方法在细胞中引入荧光团。虽然5在溶酶体中迅速积累，但其DHA嵌合体7是否会在溶酶体中表现出类似的趋向性还不能合理预测，需要进一步的研究。考虑到这一点，作者从1和2开始合成了一系列12个新的天然产物衍生物，后者在四氢吡喃环C4上额外含有一个甲基取代基。这有望赋予额外的亲脂性，从而更好的脂膜交叉电位。此外，narasin环上的一个额外甲基的存在会改变这个天然产物及其衍生物的整体构象，这可能会正面或负面地影响脂膜稳定性，潜在地影响生物活性。
Figure 3.Synthetic Route Leading to Iron-Reactive Prodrugs.
接下来，作者评估了嵌合体对Fe(II)的反应性，之前发现间充质癌细胞的特征是细胞中存在较高水平的铁，更具体地说，溶酶体中存在化学反应性Fe(II)池。使用与溶酶体中发现的类似的反应条件(例如，37 ℃, pH 5.5)。实验验证表明，在UPLC-MS观察到的24小时内，过氧化物内13在Fe(II)的存在下逐渐被消耗，这与相应的羧酸盐10的逐步出现相伴。
Figure 4.UPLC-MS analysis of Fe(II)-mediated prodrug activation.
评估了前药物和母体结构对转化的人乳腺上皮细胞HMLER cd44高/ cd24低细胞(一种稳定于间充质状态的人乳腺癌干细胞模型)和对照上皮细胞HMLER cd44低/ cd24高细胞的生物活性。与母体化合物相比，前药物在相同浓度范围内具有生物活性。这表明，DHA作为一种受自身药理特性限制的底物，对羧酸盐进行功能化并不能改变嵌合体在溶酶体中积累的倾向。2的衍生物通常比1衍生的化合物更有效。例如，17对间充质HMLER细胞的IC50值分别为0.19 uM和0.48 uM，强于16。抗增殖活性对细胞间充质状态更明显，这与高铁负荷的细胞状态相一致。药物7、13、14和15对非致瘤性上皮细胞的毒性比它们各自的母化合物5、10、11和12要小，这验证了使用铁切割前药物可以扩大治疗窗口的观点。重要的是，在一些患者来源的胰腺癌细胞中，前药物被发现比母化合物更有效。例如，在PDAC053T细胞中，15比12更有效。最后，在大多数细胞系中，在C20处具有反向立体化学的化合物21比7更有效，环丙基衍生物比丙炔胺类似物更有效。作为对照，DHA没有表现出有效的抗增殖特性，这表明DHA只是一个不稳定的羧酸盐保护组，而不是一个普遍的药效团(表1)。
Figure 5.IC50 in μM of the Anti-proliferative Activity of Natural Products and Derivatives.
作者采用原位点击化学方法通过荧光显微镜评估前药物是否确实在溶酶体中积累。细胞标记显示小荧光点状物与溶酶体追踪器和溶酶体蛋白Lamp-1共定位，但不与内质网、高尔基体或线粒体标记共定位。没有观察到与内体小泡标记物的共定位，并且在较低温度下培养细胞以干扰内吞过程并没有阻止细胞摄取5，这表明这些化合物是通过穿过质膜而不是通过内吞作用进入细胞的。此外，由于C1处存在稳定的甲基保护基团，阻止了有效的金属结合，6的效力大大低于5，也产生了类似的染色模式，表明不是铁的存在支配溶酶体靶向，而是天然产物支架的内在药理作用不可避免地导致溶酶体积累。最重要的是，嵌合体7的标记还揭示了溶酶体的积累，表明DHA保护组不影响靶向这个细胞器。
Figure 6.(a) Experimental setup of in situ click chemistry to label 5, 6, and 7 in cells. (b) Colocalization analysis of 5, 6, and 7 with markers of lysosomes, the endoplasmic reticulum (ER), the Golgi apparatus, mitochondria and early endosomes. For representative images.
接下来，作者评估前药物是否在细胞中分裂形成生物活性药物。用前药物15处理PDAC053T细胞3小时，然后用PBS洗涤几次后分析细胞裂解液。采用超高效液相色谱-质谱联用技术检测到具有生物活性药物12保留时间和质量的化合物的存在。这表明溶酶体中暴露于Fe(II)后可以激活前药物，释放出具有生物活性的与铁相互作用的羧酸盐。5和7诱导的溶酶体铁滞留是通过溶酶体Fe(II)反应探针RhoNox- M的荧光增加来定义的。化合物5和化合物7而非对照6诱导的铁滞留导致ROS的产生和脂质过氧化，这一现象被铁死亡抑制剂Liproxstatin-1逆转。这表明盐霉素衍生物和DHA的嵌合体，会优先诱导细胞铁性死亡，而DHA在较高浓度下会诱导细胞凋亡。此外，用5和7处理细胞并没有诱导PARP裂解，而是导致GPX4和系统xCT水平的增加，这两个蛋白被认为负调控铁死亡。GPX4和系统xCT的增加可能反映了这些细胞对脂质过氧化增加的反应能力。或者，治疗可能会优先杀死处理脂质过氧化物能力降低的细胞，导致细胞过度表达这些蛋白质。这也与先前报道的胰腺癌组织对铁死亡的易感性一致。
Figure 7.Flow cytometryof annexin-V versus propidium iodide in cells treated with 5, 7, the ferroptosis inducer RSL3, or DHA for 48 h and cotreated with 1 uM Liproxstatin-1, 10 uM Ferrostatin-1 (ferroptosis inhibitor), or 50 μM ZVAD-FMK (apoptosis inhibitor).
总之，作者开发了一系列前药，其中铁作为化学触发器释放生物活性小分子，同时也是间充质细胞状态的机械药物靶标。在2D和3D癌症模型中分析这些化合物识别出几种新的有效结构。虽然最近关于铁死亡的文献在很大程度上偏向于处理ROS积累的蛋白质抑制剂（例如 GPX4、xCT 系统、FSP1），但在此表明胰腺导管腺癌的耐药细胞中溶酶体铁可以被利用和直接操纵以产生脂质ROS并促进铁死亡，这仍然代表着未满足的医疗需求。这项研究说明了活动性铁死亡的概念，这是这种细胞死亡方式以前被忽视的特征。这与被动铁死亡形成对比，后者涉及对发生在铁化学下游的氧自由基的管理。由于铁死亡代表了一种可用于规避癌症耐药性的脆弱性，因此这项工作为靶向耐药持久性癌细胞提供了一种令人兴奋的新选择。
DOI:doi.org/10.1021/jacs.2c03973
