化疗耐药新见解！华中科技大学发文：改善癌症患者化疗效果有前景的治疗靶点

【导读】骨肉瘤（OS）是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，起源于成骨的间充质细胞。尽管在手术切除和新辅助化疗方面取得了进展，但化疗耐药性仍然是一个重大挑战，导致转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率较低。

12月26日，华中科技大学研究团队在期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表了题为OTULIN confers cisplatin resistance in osteosarcoma by mediating GPX4 protein homeostasis to evade the mitochondrial apoptotic pathway的研究论文，本研究结果表明，在顺铂处理后，骨肉瘤组织和细胞系中 OTULIN 的表达显著上调，而在阿霉素或甲氨蝶呤处理后则无此现象。高 OTULIN 表达与肉瘤患者的生存率降低有关。此外，对化疗前和化疗后的骨肉瘤组织进行免疫组化分析发现，化疗后样本中的 OTULIN 表达增加。体外实验结果表明，OTULIN 在介导骨肉瘤对顺铂的耐药性方面起着关键作用。从机制上讲，GPX4 可能是 OTULIN 的下游靶点，通过阻断线粒体凋亡途径而非铁死亡，赋予骨肉瘤顺铂耐药性。具体而言，OTULIN 通过降低 GPX4 的泛素化水平，阻止其被蛋白酶体降解，从而赋予骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。本研究发现为OS化疗耐药的分子机制提供了新的见解，并为未来的临床干预提供了潜在的治疗靶点。

背景信息

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骨肉瘤（OS）是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，起源于骨形成间充质细胞。目前，手术切除联合新辅助化疗使患者的5年总生存率（OS）从不足20%提高到超过60%。然而，许多转移或复发OS患者的总生存率约为20%，因为化疗耐药目前仍是OS治疗失败的原因之一。多项研究表明，在对初始化疗反应不佳的OS患者中，无论是增加一线化疗药物的浓度，还是加用其他二线化疗药物，均导致疗效非常有限。因此，探索逆转化疗耐药的新靶点对改善OS患者预后具有重要意义。

近年来，OTULIN被确定为参与细胞死亡和炎症的关键线性去泛素化酶。越来越多的证据表明，异常的线性泛素化与一系列免疫功能障碍和炎症性疾病有关。然而，OTULIN在OS中的作用，尤其是在化疗耐药的OS中，尚未被充分研究。由于OTULIN在某些情况下可促进细胞存活，因此OTULIN与OS化疗耐药的关系值得关注。

GPX4与OTULIN相互作用并逆转OTULIN敲低促进的顺铂诱导的细胞死亡

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为了阐明OTULIN促进骨肉瘤细胞抗凋亡的机制，研究人员使用一种抗OTULIN特异性抗体对143B细胞进行了免疫沉淀（IP）分析，并通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析样品中潜在的相互作用蛋白。 接下来，研究人员通过IP实验验证了GPX4与OTULIN的相互作用，发现OTULIN可以与GPX4相互作用。之后，研究人员通过免疫荧光共定位研究了正常条件下U2OS细胞中GPX4和OTULIN的相互定位，发现OTULIN和GPX4主要定位于细胞质；在细胞质中，GPX4和OTULIN的荧光重叠。既往研究报道GPX4可能作为线粒体凋亡通路的抑制分子；因此，研究人员假设GPX4可能是OTULIN的下游靶蛋白。为了验证这一假设，研究人员探索了GPX4敲低是否会加重顺铂诱导的细胞死亡。研究结果表明，GPX4缺乏加重了顺铂诱导的一种细胞死亡，更有利于细胞凋亡。接下来，研究人员发现由OTULIN缺陷引起的顺铂诱导的细胞死亡可以被GPX4过表达所逆转，相反，由GPX4缺陷引起的顺铂诱导的细胞死亡不能被OTULIN过表达所逆转。因此，GPX4可能是OTULIN抵抗顺铂诱导的细胞凋亡的潜在靶点。

OTULIN-GPX4轴通过阻断线粒体凋亡通路增加骨肉瘤对顺铂的耐药性

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研究人员假设骨肉瘤细胞中OTULIN缺失导致的顺铂诱导的凋亡增加与GPX4缺乏和线粒体氧化应激增加有关。为了验证这一假设，研究人员评估了骨肉瘤细胞中总ROS （DCFH-DA）和线粒体ROS （Mito SOX）的水平。OTULIN敲低显著增加了顺铂诱导的总ROS和线粒体ROS水平，该效应被NAC和GPX4过表达抑制。此外，顺铂处理的OTULIN敲低细胞的凋亡率增加，GPX4过表达和NAC逆转了细胞的凋亡率。蛋白质免疫印迹实验结果显示，过表达GPX4可逆转顺铂诱导的cleaved caspase 3蛋白水平的升高。

OTULIN-GPX4轴通过阻断线粒体凋亡途径赋予骨肉瘤对顺铂的耐药性

为了验证上述结果，研究人员利用CRISPR/Cas9系统构建了OTULIN基因敲除的143B细胞株。结果表明，GPX4过表达有效逆转了OTULIN敲除细胞中顺铂诱导的cleaved caspase-3蛋白水平升高。此外，在OTULIN敲除的细胞中，外源性OTULIN过表达逆转了顺铂诱导的cleaved caspase-3蛋白水平的升高。然而，OTULIN过表达并不能逆转顺铂诱导的gpx4敲低细胞中cleaved caspase-3水平的增加。综上所述，这些发现表明GPX4可能是OTULIN的下游靶点，通过阻断线粒体凋亡通路而导致骨肉瘤对顺铂耐药。

结论

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本研究揭示了OTULIN在OS化疗耐药中的机制，并揭示了OTULIN通过调节GPX4蛋白的稳定性来抑制顺铂诱导的细胞凋亡，从而赋予OS细胞对化疗药物的耐药性。本研究发现为OS的化疗耐药提供了新的见解，并提示OTULIN-GPX4轴可能是改善OS患者化疗结局的一个有前景的治疗靶点。

【参考资料】

【关于投稿】，